Kit de prueba de Tiamulin Elisa para tejido

 

1. Antecedentes
Tiamulin es un antibiótico de pleuromutilina que se utiliza en la medicina veterinaria, especialmente para cerdos y aves de corral. Se ha establecido un LMR estricto debido al posible efecto secundario en humanos.
HPLC o LC-MS es el enfoque común para detectar tiamulina, y es limitado por el alto costo y costo en el pre-tratamiento de la muestra. ELISA es rápido y preciso, que puede usarse para la detección de residuos de tiamulina muestras musculares.
2. Principio de prueba
Este kit se basa en la tecnología ELISA indirecta-competitiva. Los pocillos de microtitulación están recubiertos con antígeno de acoplamiento.  El residuo de tiamulin en la muestra compite con el antígeno recubierto en la placa de microtitulación para el anticuerpo. Después de la adición de anti-anticuerpo marcado con enzima, el sustrato de TMB se utiliza para mostrar el color. La absorbancia de la muestra está negativamente relacionada con la tiamulin que reside en ella, después de comparar con la curva patrón, multiplicada por el factor de dilución, se puede calcular la cantidad de residuos de tiamulin en la muestra.
3. Aplicaciones
Este kit está destinado al análisis cuantitativo de residuos de tiamulina en tejidos animales (cerdo y pollo, etc.).
4. Reacciones cruzadas
Tiamulin ........................ …100%
Lincomicina…..................... ….. < 0,1%
Espectinomicina................... ….. < 0,1%
Apramicina..................... ….. < 0,1%
5. Materiales necesarios
5,1 Equipo
----espectrofotómetro para placas de microtitulación (450nm/630nm)
----evaporador rotatorio/instrumento de secado de nitrógeno
----Homogenizador
--------------
---- mezclador vórtex
---- centrífuga
----equilibrio analítico (inductancia: 0,01g)
----pipeta graduada: 10ml
----Pipetón de goma
----matraz aforado: 100ml, 500ml, 1L
----tubo de ensayo de vidrio: 10ml
----tubo de centrífuga de poliestireno: 2mL, 10ml, 50ml
----tubo de vidrio para centrífuga: 10ml
----Micropipetas: 20μL-200μl, 200μl-1000μl
250ul-multipipeta
5,2 reactivos
----Acetato de etilo (AR)
----dimetilformamida (DMF,  AR)
----agua desionizada
6. Componentes del kit

1. Placa de microtitulación con 96 pocillos recubiertos de antígeno
2. Concentrado de soluciones estándar  (6 botellas × 1ml/botella)

0ppb,3ppb,9ppb,27ppb,81ppb,243ppb

1. Solución patrón de agujas: 1ppm (1ml/botella)
2. Conjugado enzimático 7ml............ tapa roja
3. Solución de anticuerpos 7ml...........
4. Solución de sustrato A 7ml .....tapa blanca
5. Solución sustrato B 7ml ...........tapón rojo
6. Solución de parada 7ml ........ tapa amarilla
7. 20×solución de lavado concentrada  40ml

cap. transparente

1. 2×solución de extracción 50ml...........

7. Preparación de reactivos
Solución  1: Solución de extracción
Diluir 2×solución de extracción concentrada con agua desionizada en la proporción de volumen de 1:1, que se utilizará para la extracción de muestras. Esta solución puede almacenarse durante 1 meses a 4ºC.
Solución  2: Diluyente de muestra
Mezclar la solución de extracción con DMF en la relación de volumen de 22:3. Mezcle completamente para su uso.
Solución  3: Solución estándar
Diluir  el concentrado de solución patrón con la solución de extracción (solución 1) en la relación de volumen de 1:9 (concentrado de solución patrón 50uL + solución de extracción 450ul). Esta  solución patrón diluida puede almacenarse durante 2h a 20-25ºC.
Solución  4: Solución de lavado
Diluir la solución de lavado 20xconcentrated con agua desionizada en la proporción de volumen de 1:19, que se utilizará para enjuagar la placa. La solución de lavado diluida puede almacenarse durante un mes a 4ºC.
8. Preparaciones de muestra
8,1 Aviso y precauciones antes de la operación
(A) por favor, use puntas de una sola vez en el proceso de experimento, y cambie las puntas cuando absorba diferentes reactivos.
(b) asegurarse de que todas las herramientas experimentales estén limpias.
8,1  tejidos animales (cerdo, pollo, etc.)
----pesar 0,05g±2,0 muestra de tejido homogeneizada en un tubo de centrifugación de poliestireno 50ml, y añadir 8ml de acetato de etilo, agitar ferozmente para 10min, y luego centrifugar para 5min, a 20-25ºC, a 3000g.
----transferir 1ml del líquido transparente sobrenadante a un tubo de vidrio limpio 10ml, seco con flujo de gas nitrógeno de 50-60ºC.
----disolver el remanente seco con 1ml de diluyente de muestra (solución 2), vórtice para 1min (la muestra puede ser turbia, no influirá en el resultado).
----tomar 50μl de la solución preparada para el ensayo.

Factor de dilución.................... 4

9. Proceso de ensayo
9,1 Aviso antes del ensayo
9.1.1 Asegúrese de que todos los reactivos y micropocillos estén a temperatura ambiente (20-25ºC).
9.1.2 Volver todos los reactivos restantes a 2-8ºC inmediatamente después de su uso.
9.1.3 el lavado correcto de los micropocillos es un paso importante en el proceso de ensayo; es el factor vital para la reproducibilidad del análisis ELISA.
9.1.4 Evite la luz y cubra los micropocillos durante la incubación.
9,2 pasos de ensayo
9.2.1 saque todos los reactivos a temperatura ambiente (20-25ºC) durante más de 30min, agítelo suavemente antes de su uso.
9.2.2 saque los micropocillos necesarios y devuelva el resto a la bolsa de cierre a 2-8ºC inmediatamente.
9.2.3 número: Numere cada posición de micropocillo y todos los patrones y muestras deben ser analizadas por duplicado. Registre las posiciones de las muestras y los estándares.
9.2.4  Añadir solución patrón/  muestra / conjugado enzimático / anticuerpo: Añadir 50µl  de solución patrón(solución 3)  / muestra a los pocillos correspondientes, añadir 50µl de conjugado enzimático (componente kit), 50µl de anticuerpo (componente kit), agitar suavemente para mezclar completamente. Y luego incubar a 37ºC para 30min con tapa.
9.2.5  lavar: Retirar la tapa suavemente y verter el líquido de los pocillos y enjuagar los micropocillos con 250µl de solución de lavado diluida (solución 4) en el intervalo de 10s durante 4-5 veces. Absorba el agua residual con papel absorbente.
9.2.6  coloración: Añadir 50µl de solución A(componente del kit) y 50µl de solución B(componente del kit) a cada pocillo. Mezclar suavemente agitando la placa manualmente e incubar durante 15min a 37°C con la tapa  (ver 12,8).
9.2.9 medida: Añadir 50µl de la solución de tope (componente del kit) a cada pocillo. Mezclar suavemente agitando la placa manualmente y medir la absorbancia a 450nm (se sugiere medir con doble longitud de onda 450/630nm. Lea el resultado en 5min después de añadir la solución de parada)
10. Resultados
10,1 Porcentaje de absorbancia  
Los valores medios de absorbancia obtenidos para los patrones y las muestras se dividen por el valor de absorbancia del primer patrón (patrón cero) y se multiplican por 100%. El patrón cero se hace así igual al 100% y los valores de absorbancia se citan en porcentajes.
=
B --patrón de absorbancia (o muestra)
B0 --patrón de absorbancia cero
10,2 curva estándar
Para trazar una curva estándar: Tomar el valor de absorbancia de los patrones como eje y, semi logarítmico de la concentración de la solución patrón de tiamulina (ppb) como eje X.
La concentración de tiamulina de cada muestra (ppb), que puede leerse en la curva de calibración, se multiplica por el factor de dilución correspondiente de cada muestra seguido, y se obtiene la concentración real de la muestra.
Aviso:
Se ha desarrollado un programa informático especial para la interpretación de todos los datos,  que puede proporcionarse a petición.
11. Sensibilidad, precisión y precisión
Sensibilidad de la prueba: 0,3ppb
Límite de detección:
Tejido......... …...….................................... 2ppb
Precisión:
Tejido........................................ …80±15%
Precisión:
El coeficiente de variación del kit ELISA es inferior al 10%.
12. Aviso
12,1 los valores medios de absorbancia obtenidos para los patrones y las muestras se reducirán si los reactivos y las muestras no se han regulado a temperatura ambiente (20-25ºC).
12,2 no permita que los micropocillos se sequen entre pasos para evitar repeticiones sin éxito y opere el siguiente paso inmediatamente después de tocar el soporte de micropocillos.
12,3 agite  suavemente cada reactivo antes de usarlo.
12,4  mantenga su piel alejada de la solución de parada porque es la solución 0,5m H2SO4.
12,5 no use los kits desfasados. No cambie los reactivos de diferentes lotes, ya que caerá la sensibilidad.
12,6 mantener los kits ELISA a 2-8ºC, no congelar. Selle las placas de micropocillos de reposo evite la luz solar directa durante todas las incubaciones. Se recomienda cubrir las placas de microtitulación para la muestra estándar y el reactivo cromogénico incoloro es sensible a la luz.
12,7 la solución sustrato debe abandonarse si se vuelve de color.  Los reactivos pueden volverse malos si el valor de absorbancia (450/630nm) del patrón cero es inferior a 0,5  (A450nm<0,5).
12,8 la reacción de coloración necesita 15min después de añadir la solución A y la solución B. y usted puede prolongar los rangos de tiempo de incubación a 20min o más si el color es demasiado ligero para ser determinado. Nunca exceda de 25min, por el contrario, acorte el tiempo de incubación adecuadamente.
12,9 la temperatura de reacción óptima es de 37ºC. Una temperatura más alta o más baja producirá cambios en los valores de sensibilidad y absorbancia.
13. Almacenamiento
Condiciones de almacenamiento: 2-8ºC.
Período de almacenamiento: 12months