Kit de prueba de florfenicol Elisa

  Kit de inmunoensayo enzimático competitivo para Análisis cuantitativo de  Florfenicol 1. Antecedentes El florfenicol es un derivado del tiamfenicol, que se aplica ampliamente en la industria animal para controlar y tratar enfermedades, ya que tiene un costo relativamente bajo y una fuerte inhibición contra un número de gram bacteria y micoplasma. El residuo de este medicamento llevará a una posible anemia aplásica, por lo que el LMR de la cual ahora está restringido a 0,1ppm en alimentos por CAC y muchos otros países. Este kit es un nuevo producto para la detección de residuos de fármacos basado en la tecnología ELISA, que puede minimizar considerablemente los errores de operación y la intensidad de trabajo en comparación con el análisis instrumental. 2. Principio de prueba Este kit se basa en la tecnología ELISA indirecta-competitiva. Los pocillos de microtitulación están recubiertos con antígeno de acoplamiento. El residuo de florfenicol en la muestra compite con el antígeno recubierto en la placa de microtitulación para el anticuerpo. Después de la adición de anti-anticuerpo marcado con enzima, el sustrato de TMB se utiliza para mostrar el color. La absorbancia de la muestra está negativamente relacionada con el residuo de florfenicol en ella, después de comparar con la curva patrón, multiplicado por el factor de dilución, se puede calcular la cantidad de residuos de florfenicol en la muestra. 3. Aplicaciones Este kit puede utilizarse en  análisis cuantitativos y cualitativos de residuos de florfenicol en tejidos animales (músculo, hígado, pescado y camarón), leche y piensos. 4. Reacciones cruzadas Florfenicol........................ …100% Florfenicol amina........................ …0,04% Cloranfenicol......... …...... <0,1% Tiamfenicol..................... …2,2% Tiamfenicol amina.................... …<0,1% 5. Materiales necesarios 5,1 equipos: Espectrofotómetro para placas de microtitulación (450nm/630nm) Rotavapor o instrumentos de secado de nitrógeno Homogeneizador Agitador Mezclador vórtex Centrifugar Equilibrio analítico (inductancia: 0,01g) Pipeta graduada: 10ml Bulbo de goma para pipetas Matraz aforado: 500ml Botella de vidrio:15ml Tubos de centrífuga de poliestireno:2ml, 50ml Micropipetas: 20ml-200ml, 200ml-1000ml 250ml-multipipeta 5,2 reactivos: Acetato de etilo (AR) N-hexano (AR) Ácido tricloroacético (AR) Agua desionizada 6. Componentes del kit Placa de microtitulación con 96 pocillos recubiertos de antígeno Soluciones estándar (6×1ml/botella) 0ppb, 0,5ppb,1,5ppb, 4,5ppb,13,5ppb,40,5ppb    Solución patrón de aguja:(1ml/botella) 1ppm  Conjugado enzimático 12ml...... tapa roja Solución de anticuerpo 7ml................green cap Solución de sustrato A 7ml.........tapón blanco Solución sustrato B 7ml............... tapa roja Solución de parada   7ml..............tapa amarilla 20Xconcentrated  solución de lavado 40mltransparent tapón 2Xconcentrated solución de extracción 50ml...tapón azul 7. Preparación de reactivos: Solución  1:   Solución de ácido tricloroacético al 0,8% (para la muestra de leche) Pesar 1,6g ácido tricloroacético y añadir 200ml agua desionizada para mezclar completamente. Solución  2: Solución de extracción Diluir la solución de extracción 2Xconcentrated con agua desionizada en la relación de volumen de 1:1 (o según el requisito), que se utilizará para diluir la solución de anticuerpo concentrado y la extracción de muestras. La solución de extracción diluida puede conservarse durante 1 meses a 4ºC. Solución  3: Solución de lavado Diluir la solución de lavado 20Xconcentrated con agua desionizada en la proporción de volumen de 1:19  (o según el requisito), que se utilizará para enjuagar la placa. La solución de lavado diluida puede conservarse durante 1 meses a 4ºC. 8. Preparaciones de muestra 8,1 Aviso y precauciones  antes de la operación: (A) por favor, use puntas de una sola vez en el proceso de experimento, y cambie las puntas cuando absorba diferentes reactivos. (b) asegurarse de que todas las herramientas experimentales estén limpias. c) mantener las muestras no tratadas en congelación. D) las muestras tratadas pueden conservarse para 24h en oscuridad a 2-8ºC, se recomienda muestras secas (antes de disolverse con n-hexano). e) retire parte de la fase orgánica sobrenadante si la muestra tratada se emulsiona, y manténga en un baño de agua de 60ºC durante 5-10min para eliminar la emulsión, luego repita el paso de centrifugación. 8,2 tejido (pollo, hígado de pollo, cerdo, hígado de cerdo, pescado y camarón): Homogeneizar la muestra de tejido con homogeneizador; Pesar 3,0±0,05g muestra homogeneizada en un tubo de centrífuga de poliestireno 50ml, añadir 6ml acetato de etilo, agitar con agitador 10min y centrifugar 10min a temperatura ambiente (20-25ºC), al menos 3000g; Transferir 4ml de la fase orgánica sobrenadante (igual a 2g muestras) a un tubo de ensayo de vidrio limpio de 10ml, seco con un flujo de gas nitrógeno de baño de agua de 50-60ºC; Añadir 1ml n-hexano, mezclar 30s con  agitador vórtex, añadir 1ml solución de extracción (solución 1), vórtex 1min, y centrifugar 15min a temperatura ambiente (20-25ºC), al menos 3000g; Eliminar la fase orgánica sobrenadante, tomar 50ml de la fase de sustrato para el ensayo; Aviso: Añadir 1ml n-hexano para disolver el remanente seco al detectar hígado animal, luego añadir 1ml solución de extracción, agitar para 10s, centrifugar y tomar la fase de sustrato para el ensayo; aumentar el volumen de n-hexano a 2-3ml cuando se detecten muestras con alto contenido de grasa. 8,3 muestra de alimentación: Pesar 2,0±0,05g del homogeneizado en  un tubo de centrifugación de poliestireno 50ml, añadir 8ml acetato de etilo. Agitar para 5min con agitador, y centrifugar a temperatura ambiente (20-25ºC) para 5min, al menos 3000g; Transferir 1ml de la fase orgánica sobrenadante a un tubo de vidrio limpio de 10ml, seco con agua de 50-60ºC de agua de agua corriente de gas nitrógeno; Añadir 1ml  n-hexnae, vórtex para 1min, añadir 1ml solución de extracción (solución 2), vórtex para 1min, y centrifugar a temperatura ambiente  (20-25ºC) para 5min, al menos 3000g; Eliminar la fase orgánica sobrenadante, tomar 100ml de la fase de sustrato y diluir con 900ml solución de extracción (solución 2), mezclar completamente, tomar 50ml por pocillo para el ensayo. 8,3 leche cruda Homogeneizar  la muestra de leche con homogeneizador; Tomar 1ml muestra de leche en un tubo de centrífuga de poliestireno 2ml, añadir  una solución de ácido tricloroacético al 1ml 0,8% (solución 1), agitar con un agitador para mezclar completamente 5min; Centrifugar para 5min a temperatura ambiente (20-25ºC), al menos 3000g; Transferir 100μl del sobrenadante a un tubo de centrífuga de poliestireno de 2 ml, añadir 400μl de solución de extracción(solución 2), mezclar completamente; Tome 50ml por pocillo para el ensayo. 9. Proceso de ensayo 9,1 Aviso antes del ensayo: 9.1.1 Asegúrese de que todos los reactivos y micropocillos estén a temperatura ambiente (20-25ºC). 9.1.2 Volver todos los reactivos restantes a 2-8ºC inmediatamente después de su uso. 9.1.3 el lavado correcto de los micropocillos es un paso importante en el proceso de ensayo; es el factor vital para la reproducibilidad del análisis ELISA. 9.1.4 Evite la luz y cubra los micropocillos durante la incubación. 9,2 pasos de ensayo 9.2.1 saque todos los reactivos a temperatura ambiente (20-25ºC) durante más de 30min, agítelo suavemente antes de su uso. 9.2.2 saque los micropocillos necesarios y devuelva el resto a la bolsa de cierre a 2-8ºC inmediatamente. 9.2.3 todos los reactivos deben ser recombados antes de su uso. 9.2.4 número: Numere cada posición de micropocillo y todos los patrones y muestras deben ser analizadas por duplicado. Registre las posiciones de las muestras y los estándares. 9.2.5 Añadir la solución/muestra patrón: Añadir 50µl de solución patrón o muestra preparada a los pocillos correspondientes, añadir 50µl de solución de anticuerpo a cada pocillo y, a continuación, mezclar suavemente agitando la placa manualmente e incubar durante 30min a 25ºC con la tapa. 9.2.6 lavar: Retirar la tapa suavemente y verter el líquido de los pocillos y enjuagar los micropocillos con 250µl de solución de lavado diluida (solución 3) en el intervalo de 10s durante 3-4 veces. Absorba el agua residual con papel absorbente. 9,2. 7 Añadir conjugado enzimático : Añadir 100ml conjugado enzimático a cada pocillo, agitar suavemente, luego incubar durante 30min a 25ºC con la tapa, repetir el paso de lavado después de salir. 9.2.8 coloración: Añadir 50µl solución A y 50µl solución B a cada pocillo. Mezclar suavemente agitando la placa manualmente e incubar durante 15 min a 25ºC con la tapa (ver 12,8). 9.2.9 medida: Añadir 50µl de la solución de parada a cada pocillo. Mezclar suavemente agitando la placa manualmente y medir la absorbancia a 450nm contra un blanco de aire (se sugiere medir con la doble longitud de onda de 450/630nm. Lea el resultado en 5min después de añadir la solución de parada. También podemos medir a la vista sin solución de parada en la abreviatura del lector ELISA) 10. Resultados 10,1 Porcentaje de absorbancia   Los valores medios de absorbancia obtenidos para los patrones y las muestras se dividen por el valor de absorbancia del primer patrón (patrón cero ) y se multiplican por 100%. El patrón cero se hace así igual al 100% y los valores de absorbancia se citan en porcentajes.     B --patrón de absorbancia (o muestra) B0 --patrón de absorbancia cero 10,2  curva estándar   Para trazar una curva estándar: Tomar el valor de absorbancia de los patrones como eje y, semi logarítmico de la concentración de la solución patrón de florfenicol (ppb) como eje X. --- la concentración de florfenicol de cada muestra (ppb), que puede leerse en la curva de calibración, se multiplica por el factor de dilución correspondiente de cada muestra seguida, y se obtiene la concentración real de la muestra. Por favor note: Para la reducción de datos de los kits ELISA, se ha desarrollado un software especial que puede proporcionarse a petición. Factor de dilución de las muestras: Muestras de tejido (músculo, hígado, pescado y camarón): 0,5 Muestra de alimentación: 40 Leche: 10 11. Sensibilidad, precisión y precisión Sensibilidad de la prueba: 0,5ppb Muestras de tejido (músculo, hígado, pescado y camarón)...0,25ppb Muestra de alimentación............................ ….20ppb Leche........................ …....... 5ppb Precisión: Hígado de pollo/pollo 95±15% Hígado de cerdo/cerdo............................. 95±15% Pescado y camarón … 90±15% Alimentación........................ …..100±30% Leche.............................. 100±30% Precisión El coeficiente de variación del kit ELISA es inferior al 10%. 12. Aviso 12,1 los valores medios de absorbancia obtenidos para los patrones y las muestras se reducirán si los reactivos y las muestras no se han regulado a temperatura ambiente (20-25ºC). 12,2 no permita que los micropocillos se sequen entre pasos para evitar repeticiones sin éxito y opere el siguiente paso inmediatamente después de tocar el soporte de micropocillos. 12,3 agite  suavemente cada reactivo antes de usarlo. 12,4. Mantenga su piel alejada de la solución de parada porque es 2M H2SO4. 12,5 no use los kits desfasados. No cambie los reactivos de diferentes lotes, o de lo contrario caerá la sensibilidad. 12,6 mantener los kits ELISA a 2-8ºC, no congelar. Selle las placas de micropocillos de reposo evite la luz solar directa para la muestra estándar y el reactivo cromogénico incoloro es sensible a la luz. 12,7 la solución sustrato debe abandonarse si se vuelve de color.  Los reactivos pueden volverse malos si el valor de absorbancia (450/630nm) del patrón cero es inferior a 0,5  (A450nm<0,5). 12,8 la reacción de coloración necesita 10-15min después de añadir la solución A y la solución B. y usted puede prolongar los rangos de tiempo de incubación a 20min o más si el color es demasiado ligero para ser determinado, nunca exceder 30min, por el contrario, acortar el tiempo de incubación adecuadamente. 12,9 la temperatura de reacción óptima es de 25ºC. Una temperatura más alta o más baja producirá cambios en los valores de sensibilidad y absorbancia 13. Condiciones de almacenamiento y período de almacenamiento      Condiciones de almacenamiento: 2-8ºC. Periodo de almacenamiento: 12 meses.